微生物檢測(cè)基礎(chǔ)知識(shí)及常見(jiàn)消毒滅菌方式匯總
一、微生物的概念與分類(lèi)
在自然界里,有許多肉眼不能直接看見(jiàn),必須借助于顯微鏡放大才能觀察到微小生物,這些微小生物總稱(chēng)為微生物。
微生物的分類(lèi),目前*的包括七大類(lèi)。即病毒→立克次體→支原體→細(xì)菌→放線菌→螺旋體→真菌(酵母菌、霉菌)。排在前面的小而低等,排在后面的逐漸大而高等,本文內(nèi)容只重點(diǎn)介紹三類(lèi)。
二、微生物的特點(diǎn)
微生物除了個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單這一基本特征以外,還有一些其他特點(diǎn)也是與眾多生物不同的。
(一)種類(lèi)繁多
微生物的數(shù)量和種類(lèi)是十分驚人的。一滴水,一顆土粒往往都是一個(gè)微生物“社會(huì)”。其中以土壤內(nèi)的生存密度zui大,1克較肥活的土壤常含有幾億到幾十億個(gè)微生物;貧瘠土壤每克也含有幾百萬(wàn)到幾千萬(wàn)個(gè),一只骯臟的蒼蠅,全身能攜帶5億多個(gè)細(xì)菌。
三對(duì)足能粘附700萬(wàn)至1000萬(wàn)個(gè)細(xì)菌,可見(jiàn)微生物的密集度之大。微生物的各類(lèi)也很可觀,自然界已知的微生物就有10萬(wàn)種左右。
(二)分布廣泛
微生物是地球上分布zui廣泛的一類(lèi)生物。在遼闊的自然界中,無(wú)論土壤、水域、空氣以及動(dòng)物、植物、人體內(nèi)外都有大量微生物存在。有些微生物能夠在異常的條件下生存,例如耐酸菌能在10%的硫酸溶液中生活,嗜熱菌能在溫度高達(dá)98℃以上的溫泉中生活,有的甚至在高達(dá)200~300℃的深?;鹕娇诟浇材芑顒?dòng),嗜鹽菌在含鹽量高達(dá)23%~25%的死海里,甚至30%的摘錄化鈉溶液中和鹽塊上存活,顯然這是一般生物所*的。
(三)繁殖迅速
微生物的繁殖速度也是同樣驚人的,比高等動(dòng)植物快得多,有些細(xì)菌,在適宜條件下每20分鐘就可以繁殖一次,例如大腸桿菌,1個(gè)細(xì)菌經(jīng)20分鐘就分裂成2個(gè),每小時(shí)可分裂3次,這樣,1個(gè)細(xì)菌繁殖3代就產(chǎn)生8個(gè)細(xì)菌。即:
1小時(shí) =8個(gè)
2小時(shí) 8×23=64個(gè)
3小時(shí) 64×23=512個(gè)
4小時(shí) 512×23=4096個(gè)
24小時(shí) 1×272=4.7*1021
照此速度繁殖下去,24小時(shí)就可繁殖72代,數(shù)量大約為4.7*1021個(gè)。所以細(xì)菌培養(yǎng)24小時(shí)就可以看見(jiàn)菌群。其增殖速率是相當(dāng)驚人的。但因種種條件(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))限制,這種繁殖速度是不能持久的。盡管如此,微生物這種快速繁殖能力應(yīng)用到工業(yè)發(fā)酵上,在短時(shí)間內(nèi)得到大量增殖,收或較多的產(chǎn)物,也是有著重要意義的。
三、常見(jiàn)的微生物
(一) 細(xì)菌
細(xì)菌是能夠獨(dú)立地進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的單細(xì)胞生物,種類(lèi)很多,大小不一,平均約1.0μm,用顯微鏡放大1000倍,也只有1.0mm大小,所以肉眼看不見(jiàn)。
細(xì)菌的形態(tài)是不相同的,一般可歸納為三種類(lèi)型:
1.球菌 單獨(dú)存在時(shí)呈球形,按其分裂的方式和分裂后的排列,可分為單球菌、雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌等,菌體直徑約0.5~1.0μm。
2.桿菌 菌體呈桿狀或近似桿狀。大小、長(zhǎng)短、粗細(xì)很不一致,有的粗短近似球菌,稱(chēng)為球桿菌;有的桿菌一端膨大似棒狀,稱(chēng)為棒狀桿菌;有的排列成鏈狀,稱(chēng)為鏈桿菌;有的生長(zhǎng)成側(cè)枝,稱(chēng)為分枝桿菌。大部分桿菌長(zhǎng)約2.0~3.0μm,寬0.5~1.0μm,病原細(xì)菌中桿菌的種類(lèi)zui多。
3.弧菌和螺菌 菌體呈彎曲或螺旋狀,只有一個(gè)彎曲,呈逗點(diǎn)狀為弧菌,如霍亂弧菌;有數(shù)個(gè)彎曲較為堅(jiān)韌的為螺菌,如鼠咬熱螺菌。
(二)病毒
病毒是體積zui小,結(jié)構(gòu)zui簡(jiǎn)單,沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu),而只能寄生在其它生物的細(xì)胞內(nèi),利用宿主細(xì)胞的酶系統(tǒng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的原始生物。病毒的形態(tài)多數(shù)呈球形,少數(shù)呈桿狀或磚塊狀,細(xì)菌病毒(噬菌體)多數(shù)呈蝌蚪狀,平均大小只有0.1μm,比細(xì)菌約小10倍,zui小的病毒只有0.01μm,接近蛋白質(zhì)分子。病毒大多能通過(guò)濾菌器,故俗稱(chēng)濾過(guò)性病毒。
豬流感病毒
(三)真菌
真菌是體積zui大,結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的微生物。真菌在自然界里廣泛存在,如使衣物、食品發(fā)霉的霉菌,釀酒或發(fā)醇面粉的醇母菌都是真菌。病原真菌也較常見(jiàn),如皮膚淺表的癬菌。真菌對(duì)熱的抵抗力不強(qiáng),60℃加熱1小時(shí)即被殺死。真菌分單細(xì)胞真菌和多細(xì)胞真菌;單細(xì)胞真菌和多細(xì)胞真菌;單細(xì)胞真菌通稱(chēng)為酵母菌。多細(xì)胞真菌通稱(chēng)為霉菌。
酵母菌
酵母菌
霉菌
黑曲霉
四、細(xì)菌細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)
有的細(xì)菌除具有上述基本結(jié)構(gòu)外,尚有某些特殊結(jié)構(gòu),如莢膜、芽胞、鞭毛、菌毛等。
1.莢膜
有些細(xì)菌在一定的營(yíng)養(yǎng)條件下,向細(xì)胞壁表面分泌一種粘液狀物質(zhì),形成一層較厚的膜(約0.2μm)稱(chēng)為莢膜。莢膜中含有大量水分,莢膜對(duì)菌體有保護(hù)作用,可保護(hù)細(xì)菌抵抗干燥。細(xì)菌的莢膜與細(xì)菌的致病力有關(guān),具有莢膜的細(xì)菌不易被白細(xì)胞所吞噬,故能在機(jī)體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖,引起感染。
2.芽胞
某些細(xì)胞生長(zhǎng)到一定時(shí)期或當(dāng)外界條件改變時(shí)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)不利時(shí),菌體內(nèi)的細(xì)胞漿發(fā)生脫水濃縮,逐漸形成圓形或橢圓形的小體,位于菌體中央或末端,稱(chēng)為芽胞,如下圖所示,芽胞是細(xì)菌的休眠體,一個(gè)繁殖體只能形成一個(gè)芽胞。芽胞外部有數(shù)層厚而致密的膜,可抵御外界的環(huán)境,對(duì)于高溫、干燥、光線、化學(xué)藥品等有抵抗力比繁殖體為強(qiáng),沒(méi)有形成芽胞的細(xì)菌,在70℃以上就逐漸死亡,而芽胞卻能抵抗100℃或更高一些的溫度。因此,殺死芽胞要比殺死細(xì)菌的繁殖體困難得多,有的芽胞存活多年而不喪失其活力,當(dāng)遇到合適條件又可生長(zhǎng)繁殖,因此滅菌的效果應(yīng)以殺死芽胞為標(biāo)準(zhǔn)。
細(xì)菌芽孢
五、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物
1.細(xì)菌的繁殖方式
細(xì)菌的繁殖方式是簡(jiǎn)單無(wú)性二分裂法,即一個(gè)細(xì)菌分為二個(gè),二個(gè)分為四個(gè),如此繼續(xù)下去。球菌由于沿著一個(gè)平面或幾個(gè)平面,故呈鏈狀、葡萄狀、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌等狀態(tài);桿菌一般沿橫軸分裂。
大部分細(xì)菌的繁殖速度很快,如大腸桿菌在適宜的條件下,每20分鐘就可繁殖一代,若保持此速度繁殖10小時(shí)后,一個(gè)細(xì)菌可以繁殖10億個(gè)。細(xì)菌繁殖雖然如此迅速,但它是受各方面因素所制約,決不能無(wú)限制地繁殖下去。
2.生長(zhǎng)繁殖的條件
1) 水 細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖是從外界吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),通過(guò)本身含有的許多酶系統(tǒng),進(jìn)行一系列的生化反應(yīng)分解轉(zhuǎn)化成簡(jiǎn)單物質(zhì),然后加以吸收利用。水是細(xì)菌生活所不可缺水的物質(zhì)。
2)碳和氮化合物、無(wú)機(jī)鹽等 這些是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)所必須的物質(zhì)。
3)氣體 氧、二氧化碳和氮與細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖有密切的關(guān)系。有些細(xì)菌必須有充分的氧氣供應(yīng)才能生活,稱(chēng)為需氧菌,如結(jié)核桿菌;另一類(lèi)則恰相反,要在缺氧的環(huán)境下才能生活,有氧存在反而對(duì)它們生長(zhǎng)不利,稱(chēng)為厭氧菌,如破傷風(fēng)桿菌;大多數(shù)但致病菌處于這兩者之間,有氧無(wú)氧都生活的則稱(chēng)為兼性厭氧菌,如大腸桿菌。
(4)酸堿度 大多數(shù)病原菌生長(zhǎng)zui適宜的酸堿度為pH7.2~7.6。
(5)溫度 根據(jù)細(xì)菌對(duì)溫度要求的不同,可分為嗜冷菌、嗜溫菌及嗜熱菌。一般病原菌的適宜溫度基本與人類(lèi)體溫相同,因而實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)菌均采用37℃。(霉菌25℃)
3.代謝產(chǎn)物
細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖中,可產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物,有的分泌到菌體外面,有的包含在菌內(nèi),有一些代謝產(chǎn)物對(duì)人體有益,如抗生素、維生素等;但有一些代謝產(chǎn)物對(duì)人體是有害的,如熱原等,這些產(chǎn)物一旦進(jìn)入機(jī)體可以致病或使體溫升高。
六、外界環(huán)境中對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響因素
1.溫度和化學(xué)因素 溫度和化學(xué)因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖影響大,將在物理滅菌法和化學(xué)滅菌法中講述。
2.pH值 pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 ,中性繁殖zui快。
3.濕度 溫度可以促使細(xì)菌生長(zhǎng),特別對(duì)霉菌繁育更快。因此防止?jié)穸冗^(guò)大對(duì)于避免染菌霉敗有一定的作用。
水的活度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的重要性,提高食品成分結(jié)合水分能力從而改變水活度。
4.滲透壓 微生物的細(xì)胞具有半透膜的性質(zhì),可以透水,但對(duì)于其他物質(zhì)的透過(guò)則有選擇性,低滲藥液可使細(xì)胞膜膨脹,但高透藥液可使細(xì)胞內(nèi)水分滲出而處于脫水狀態(tài)。所以一般微生物在濃鹽溶液或濃糖溶液中不易生長(zhǎng)繁殖,就是由于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)水分滲出而脫水的緣故。如蔗糖是微生物的良好營(yíng)養(yǎng);單糖漿含蔗糖85%,為其等滲濃度9.25%的9倍多,卻能保持不長(zhǎng)菌;若濃度不夠,容易長(zhǎng)菌敗壞。
七、有關(guān)名詞解釋
滅菌 系指殺死或除去所有微生物的繁殖體和芽胞,使之無(wú)菌。
消毒 系指僅僅殺滅病原微生物,使之不成為傳染源。
殺菌 系指使用化學(xué)藥品或物理因素,對(duì)微生物在短時(shí)間內(nèi)起殺滅的作用。
抑菌 即抑制微生物繁殖體的生長(zhǎng)及其繁殖。
防腐 系指防止或抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的方法。
無(wú)菌 系指沒(méi)有任何活的微生物存在。
八、物理滅菌法
(一)加熱滅菌法
加熱可破壞微生物中酶、蛋白質(zhì)和核酸,導(dǎo)致微生物死亡。加熱滅菌又分干熱滅菌法和濕熱滅菌法。在同一溫度下,濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好。主要是因濕熱滅菌時(shí),有水分存在,蛋白質(zhì)容易變性。水分又易使微生物膜壁潤(rùn)濕,濕熱的穿透力比干熱大。
干熱滅菌法 常用的有火焰滅菌法與干熱空氣滅菌法兩種。
(二)紫外線滅菌法
是指用紫外線照射殺滅微生物的方法。一般用于滅菌的紫外線波長(zhǎng)是200~300nm,滅菌力zui強(qiáng)的波長(zhǎng)是253.7nm。紫外線作用于核酸蛋白促使其變性,同時(shí)空氣受紫外線照射后產(chǎn)生微量臭氧,從而起共同殺菌作用。紫外線進(jìn)行直線傳播,可被不同的表面反射,穿透力微弱,但較易穿透清潔空氣及純凈的水。因此本法適用于照射物體表面之滅菌、無(wú)菌室的空氣及水的滅菌;不適用于藥液的滅菌、固體物質(zhì)深部的滅菌;普通玻璃可吸收紫外線,因此裝于玻璃容器中的藥物不能用此法滅菌。紫外線對(duì)人體照射過(guò)久,會(huì)發(fā)生結(jié)膜炎,紅斑及皮膚燒灼等現(xiàn)象,故一般在人入室前開(kāi)啟紫外線燈1~2小時(shí),關(guān)閉后人才進(jìn)入潔凈室。如果必須在人進(jìn)去后仍要開(kāi)紫外線滅菌,則人的皮膚及眼睛應(yīng)有有效的防護(hù)措施。一般在6~15m3的空間可裝置30瓦紫外線燈一盞,離地面2.5~3m為宜。
用紫外線照射滅菌時(shí)要注意下列問(wèn)題:
1、紫外線的殺菌力,隨使用時(shí)間增加而減退,一般使用時(shí)間達(dá)到額定時(shí)間70%時(shí)應(yīng)更換紫外線燈管,以保證殺菌效果。國(guó)產(chǎn)紫外線燈平均壽命一般為2000h。
2、紫外線的殺菌作用隨菌種不同而不同,殺霉菌的照射量要比殺桿菌大40~50倍。
3、紫外線照射通常按相對(duì)濕度為60%的基礎(chǔ)設(shè)計(jì),室內(nèi)濕度增加時(shí),照射量應(yīng)相應(yīng)增加。
4、紫外線滅菌效果與照射的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān),這需要通過(guò)驗(yàn)證來(lái)確定照射時(shí)間。
5、紫外照射燈的安裝形式及高度,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況,參考使用說(shuō)明決定。
滅菌方法的驗(yàn)證采用生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn),生物指示劑多用枯草芽孢桿菌。
(三)微波滅菌法
微波是指頻率在30~3000MHz之間的電磁波。水可強(qiáng)烈地吸收微波,使其性分子轉(zhuǎn)動(dòng),分子間的磨擦而生熱,且升溫迅速,靠熱力而滅菌。在數(shù)十秒至幾分鐘之內(nèi)可達(dá)100~150℃,并全部殺死液體中的微生物,適于水溶性注射液的滅菌。另外,固體藥材飲片及固體制劑(丸劑、散劑、膠囊粉等)也含少量水分,微波能穿透到固體內(nèi)部,由表至里被均勻加熱,而起干燥、滅菌的作用。多用于口服液體制劑的滅菌,有望用于注射液的滅菌。但可能對(duì)某些藥品的PH值、含量、顏色有影響。
(四)輻射滅菌法
輻射滅菌是應(yīng)用γ射線、β射線殺滅細(xì)菌的方法,又稱(chēng)電離輻射,前者由鈷-60或銫-137發(fā)出,穿透力強(qiáng);后者由電子加速器產(chǎn)生,帶電荷,穿透力弱,滅菌效果差。
九、化學(xué)滅菌法
化學(xué)滅菌法系指用化學(xué)藥品來(lái)殺滅微生物的方法。同一種化學(xué)藥品的低濃度時(shí)呈現(xiàn)抑菌作用,而在高濃度時(shí)則能起殺菌作用。其殺菌機(jī)理可能是:能使微生物蛋白質(zhì)變性死亡,或與酶系統(tǒng)結(jié)合影響代謝,或改變膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒劑消毒法和化學(xué)氣體滅菌法等。
(一)消毒劑消毒法
消毒是指殺死病原微生物的方法。但化學(xué)消毒劑大多僅能殺死微生物的繁殖體而不能殺死芽孢,能控制一定范圍的無(wú)菌狀態(tài)。可將消毒劑配成適宜濃度,采用噴淋、涂擦或浸泡等方法對(duì)物料、環(huán)境、器具等進(jìn)行消毒。常用的化學(xué)消毒劑有0.1%~0.2%苯扎溴銨溶液、3%~5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物體表面滅菌。但要注意其濃度不要過(guò)高,以防止化學(xué)腐蝕作用。潔凈室的墻面、天花板、門(mén)窗、機(jī)器設(shè)備、儀器、操作臺(tái)、車(chē)、桌、椅等表面以及人體雙手(手套)在環(huán)境驗(yàn)證及日常生產(chǎn)時(shí),應(yīng)定期清潔并用消毒劑噴灑,無(wú)菌室用的消毒劑必須在層流工作臺(tái)中,用0.22μm的濾膜過(guò)濾后方能使用。
(二)化學(xué)氣體滅菌法
系指利用化學(xué)藥品的氣體或產(chǎn)生的蒸汽進(jìn)行殺滅微生物的方法。
1.環(huán)氧乙烷滅菌法
環(huán)氧乙烷滅菌法是利用環(huán)氧乙烷氣體進(jìn)行殺菌的方法。它是一種傳統(tǒng)的滅菌方法,可應(yīng)用于工衣滅菌、不耐加熱滅菌的藥品、醫(yī)用器具、設(shè)施、設(shè)備等的滅菌。
環(huán)氧乙烷滅菌系統(tǒng),主要有下列四項(xiàng)互相制約的重要因素影響滅菌效果:
1、溫度;2、濕度;3、氣體濃度;4、滅菌時(shí)間。
因?yàn)榄h(huán)氧乙烷是易燃易爆物質(zhì),明火可以引起燃燒,同時(shí)由于氣體分解還可能引起,環(huán)氧乙烷滅菌中應(yīng)十分注意安全問(wèn)題。
2.甲醛等蒸汽熏蒸法
采用甲醛、丙二醇或過(guò)氧醋酸等化學(xué)品,通過(guò)加熱產(chǎn)生蒸汽進(jìn)行空氣環(huán)境滅菌。
(1)、計(jì)算房間體積,按10g/m3的比例稱(chēng)出甲醛。
(2)、將甲醛倒入甲醛發(fā)生器或加熱盤(pán)或燒杯中,并放好加濕用水,必要時(shí)還需加入高錳酸鉀(2~3g/m3),然后加熱(甲醛發(fā)生器用蒸汽加熱,加熱盤(pán)或燒杯用熱水盛入其中加熱)使其蒸發(fā)成氣體。
(3)、滅菌流程:空調(diào)器停止運(yùn)轉(zhuǎn)→啟動(dòng)甲醛氣體發(fā)生器或在加熱盤(pán)中加熱甲醛 →讓甲醛氣體擴(kuò)散約30分鐘→啟動(dòng)空調(diào)器讓甲醛氣體循環(huán)約30分鐘→停止空調(diào)器,房間熏蒸消毒,時(shí)間不少于8小時(shí)→ 房間排氣,用新鮮空氣置換約2小時(shí)→ 恢復(fù)正常運(yùn)行。
當(dāng)相對(duì)濕度在65%以上,溫度在24~40℃時(shí),甲醛氣體的消毒效果。
3、臭氧消毒法
臭氧(O3)的消毒原理是:臭氧在常溫、常壓下分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,很快自行分解成氧(O2)和單個(gè)氧原子(O),后者具有很強(qiáng)的活性,對(duì)細(xì)菌有強(qiáng)的氧化作用,臭氧氧化分解了細(xì)菌內(nèi)部氧化葡萄糖所必須的酶,從而破壞其細(xì)胞膜,將其殺死。多余的氧原子則會(huì)自行重新結(jié)合成為普遍氧分子(O2),不存在任何有害殘留物,故稱(chēng)為無(wú)污染消毒劑。它不但對(duì)種種細(xì)菌(包括肝炎病毒、大腸桿菌、綠膿桿菌及雜菌等)有強(qiáng)的殺滅能力,而且對(duì)霉菌也很有效。
十、無(wú)菌操作法
無(wú)菌操作室應(yīng)達(dá)到GMP的規(guī)定,為達(dá)無(wú)菌的要求可采取綜合措施:
①應(yīng)采用層流潔凈空氣技術(shù);
②可采用甲醛等蒸汽熏蒸法消毒和紫外燈滅菌法進(jìn)行空氣環(huán)境滅菌;
③室內(nèi)用具、墻、桌等暴露面用消毒劑噴、擦消毒;
④其他物品可熱壓或干熱法滅菌;
⑤操作人員衣、帽、鞋、手等消毒及滅菌。
無(wú)菌操作室應(yīng)定期進(jìn)行菌落檢查。一般采用培養(yǎng)皿暴露20~30min,37℃培養(yǎng)48h,每只培養(yǎng)皿內(nèi)不過(guò)3個(gè)菌落為合格。
十一、食品的防腐與防腐劑
微生物有水分及其他適宜條件就可以繁殖,很多食品易被微生物污染,所以除采用適當(dāng)方式滅菌外,可加防腐劑以抑、殺微生物。
防腐劑,又稱(chēng)抑菌劑,系指能抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的物質(zhì),常用的防腐劑有:
1.苯甲酸與苯甲酸鈉 為常用的有效防腐劑,一般用量為0.1%~.25%。苯甲酸水溶性較差,而苯甲酸鈉水溶性好,易溶解,應(yīng)用方便。
2.對(duì)羥基苯甲酸酯(尼泊金類(lèi)) 有甲、乙、丙、丁四種酯,抑霉菌作用較強(qiáng),一般用量為0.01%~0.25%。
3.山梨酸與山梨酸鉀 山梨酸的分子結(jié)構(gòu)式為CH3—CH=CH—CH=CH—COOH,常用濃度為0.15%~0.05%。對(duì)細(xì)菌和霉菌均有較強(qiáng)抑菌效力。
4.其他 含20%以上乙醇、含30%以上的甘油、中藥中很多揮發(fā)油及0.1脫水醋酸等均有防腐效力。